Качество хитозансодержащих фитопрепаратов для фитохитодезтерапии

Комаров Б.А., Албулов А.И., Шинкарев С.М., Фоменко А.С. ИПХФ РАН, ВНИТИ БП РАСХН

Одна из целей конференции является информация о последних достижениях в технологии изготовления фитопрепаратов и биологически активных добавок к пище (БАД) и их применения в фитотерапии. Это актуально именно сейчас, когда в стране происходит постепенное вытеснение зарубежных БАД отечественными. Если 5-6 лет тому назад среди зарегистрированных БАД было ~ 80 % зарубежных и ~ 20 % отечественных, то в настоящее время при существенном росте общего объема зарубежных БАД стало 60 %, соответственно, отечественных - 40 %. Распространение отечественных достижений важно еще и потому, что из всех применяемых в стране БАДов, включая и хито-зансодержащие, только ~ 12 % зарегистрировано. Эти сведения были озвучены на семинаре регионального терапевтического общества в конце 2002. Все это обусловлено растущим многообразием БАД, есть немало и подделок, малоэффективных, несертифицированных и незапатентованных препаратов. Известно, что хитозансодержащие препараты не являются исключением.

Для изготовления БАД в основном используется лекарственное растительное сырье и вещества естественного происхождения, к которым относятся хитин, хитозан и их производные. Поэтому прежде всего современному врачу да и всем пациентам важно знать о всех новых данных в исследовании, что поможет точнее и правильно определиться с эффективным способом профилактики и лечения с минимумом осложнений или вообще без них.

Фитохитодезтерапия - это не только применение фитохитодезов -молекулярных комплексов экстрактов фитосборов и водорастворимых форм хитозана полифракционного состава [1, 2], но и наружное применение хитозансодержащих фитомазей одновременно или с определенной последовательностью в соответствии с диагнозом заболевания. Очевидно, что эффективность профилактики и лечения прежде всего будет определяться составом сбора лекарственных растений [3-6]. Для хитозансодержащих фитопрепаратов немаловажное значение имеют как молекулярные характеристики хитозана, на основе которого изготавливается фитопрепарат или фитомазь, так и технология получения целевого продукта.

Рассмотрим некоторые биохимические аспекты применения хи-тозансодержащих сублинпзальных фитопрепаратов, введенных нами в 1994 [7] и оказавшихся наиболее удобными и эффективными. Одно из основных положительных качеств хитозана - это его имму-нокоррегирующее действие. Жоголевым К.Д. с сотрудниками [8, 9] на основании результатов многолетних собственных исследований, а также зарубежных достижений показал, что иммунокоррегирую-щее действие хитозана проявляется на этапе захвата антигена макрофагами, передачи антигенной информации В-лимфоцитам и активации клеток В-системы иммунитета. Установлено, что повышенной биологической активностью обладает хитозан со степенью де-ацетилирования (СД) около 70 %. Под его действием отмечается выработка моноцитами фактора некроза опухоли альфа (ФНОи), активация альвеолярных макрофагов опосредуется через д-интер-ферон, продуцируемый NK- и СД4-клетками. Наряду с активацией хемотаксиса макрофагов происходит стимуляция выработки оксида азота и прямая активация предшественников Т-хелперов комплексами хитозана с антигенами или эритроцитами, спонтанно образующимися в организме. Установлено, что концентрация хитозана 25-30 мкг/мл в 2-4 раза увеличивает количество провзаимодей-ствовавших лимфоцитов с макрофагами вследствие изменения поверхностного заряда клеток. Хитозан оказывает влияние на самых ранних этапах становления иммуногенеза.

Очевидно, что такое действие хитозана эффективно будет проявляться при наличии его в крови. А может ли хитозан усваиваться и в какой степени при пероральном применении? В определенной степени на этот вопрос могут ответить результаты испытания на мышах с радиоактивно меченым хитозаном. Было показано, что при пероральном применении не только олигомерного хитозана (от мономера до октамера), но и высокомолекулярного хитозана с молекулярной массой (ММ) - 87 «Да происходит частичное усваивание хитозана и уже через несколько минут после применения он обнаруживается не только в крови, но и во всех органах (печени, почках, селезенке, тимусе, мозгу и суставах) [2, стр. 246].

Особенно важно отметить факт тенденции повышенного содержания хитозана при его введении с настоем сбора лекарственных растений: плоды шиповника, корни солодки голой, трава мяты перечной и зверобоя продырявленного по 20 вес. ч., трава крапивы двудомной и донника лекарственного по 10 вес. ч. [6]. Обусловлено это может быть несколькими факторами. Во-первых, некоторые лек-тины растительного происхождения могут выполнять роль хитиназы или хитозаназы. Во-вторых, хитозан, поступая в желудочно-кишечный тракт вместе с экстрактом фитосбора, может активизировать ферменты человека типа хитотриозидаз [10], лизоцима. Кроме этого, хитозан может разрушаться Н202 и активными формами кислорода [11], особенно, если в хитозансодержащем фитопрепарате имеется повышенное содержание железа, меди и других металлов с переходной валентностью. Наконец, растительные вещества (возможно и хитозан) могут активизировать жизнедеятельность кишечной микрофлоры, следовательно, повышать активность и хитиназ энте-робактерий [11]. Все это должно приводить к расщеплению хитозана по |3-(1-4)-гликозидной связи и накоплению легко усвояемой оли-гомерной фракции хитозана. Исследования в этой области по существу только начаты. Перечисленные причины деструкции хитозана в основном имеют предположительный характер, но уже сейчас ясно, что лечебный эффект гепаферма (фитохитодез на основе вышеуказанного сбора лекарственных растений [6]) обусловлен наличием хитозана в печени, где комплексы его с гепарином [12] оказывают антикоагуляционное действие, способствующее ускоренному выводу токсинов, кроме этого эти комплексы активируют ферменты и осуществляют дезинтоксикацию, устраняя очаги воспаления и восстанавливая работоспособность печени.

Рассмотрим другую сторону положительного влияния хитозана и фитохитодезов - бактериостатическое действие. Первые исследования в этой области были проведены в Черноголовке в 1995 г. [4]. Затем развитие работ было продолжено в Тверской медицинской академии микробиологом Червинцом В. М. [13], диссертация которого включает результаты исследования чувствительности патогенной микрофлоры ЖКТ к хитозану с различной ММ и СД. Имеются и другие исследования, демонстрирующие высокую чувствительность микроорганизмов к низкомолекулярному, растворимому при нейтральном рН в воде хитозану с ММ от 5 до 27 кДа [14]. Механизм действия хитозана обусловлен, вероятно, его природой кати-онного полиэлектролита, способного адсорбироваться на участках поверхности бактерии с повышенной электронной плотностью, что может приводить к нарушению целостности наружной мембраны и увеличению ее проницаемости до критических пределов [13, 14].

Из этих работ следует, что чувствительность различных классов микроорганизмов зависит не только от ММ хитозана, но и от СД. Следовательно, применение хитозана полифракционного состава по ММ и СД для получения хитозансодержащих фитопрепаратов будет расширять и усиливать их антибактериальное действие. Это хорошо демонстрируется антибактериальной активностью сертифицированного фитохитодез-02, полученного на основе хитозана полифракционного состава (табл. 1).

Таблица 1

Чувствительность микроорганизмов к водным экстрактам сборов трав и фитохитодезу-02 в среде с рН s 7,0

№	Микроорга-	Сбор из	Конский	Плас-	Фито-	Фито-	0,25%
п/п	низмы	3-х трав	щавель	тофарм № 1	хито-дез- 02 в воде	хито-дез- 02 cHCI	HCI
Г	рамотрицательные
1.	E.coli	0	0	0	0	1	1
2	Alcaligenes denitrificans	0	1	0	0	1	1
3.	Serratia marcescens	2	0	0	0	1	1
4.	Citrobacter freundii	0	0	0	0	1	2
5.	Acinetobacter anitratus	0	0	0	0	1	1
6.	Hafnia alvei	0	0	0	0	2	0
7.	Yersinia
	pseudotubercu	0	0	0	2	2	2
	losis
8.	Shigella spp.	0	0	0	0	2	1
9.	Pseudomona s putida	0	0	0	0	2	2
10.	P. maltophilia	0	0	0	0	0	0
11.	P. vesiculans	0	0	0	2	1	2
12.	P. putrefaciens	0	0	0	0	2	2
13.	P. cepacia	0	0	0	0	2	2
14.	Helicobacter pylori	0	0	0	0	2	2

Продолжение таблицы 1

Грамположительные
15.	Staphylococc us aureus	0	0	0	0	3	0
16.	Staphylococc us spp.	0	0	0	0	2	0
17.	Peptococcus	1	1	1	1	2	1
	spp.
18.	Peptococcus niger	0	0	0	2	2	2
19.	Streptococcu s salivarius	1	0	0	0	2	0
20.	Streptococcus intermedius	0	0	0	0	3	2
21.	Peptostreptoc occus spp.	0	0	0	0	2
22.	Criptococcus spp.	0	0	0	2	2	0
23.	Bacillus spp.	0	1	0	1	2	0
24.	Lactobacillus spp.	0	0	0	0	2	1
25.	Bifidobacteriu m bifidum	0	0	0	0	2	2
Грибы
26.	Candida albicans	0	0	0	0	2	0
27.	C. parapsilosis	0	0	0	2	2	0
28.	C. crusea	0	0	0	1	1	0
29.	C. tropicalis	0	0	0	1	3	0
30.	C. pseudotro-picalis	0	0	0	1	3	1

Примечание: 0 - отсутствие чувствительности,

• 1 - слабая чувствительность,
• 2 - средняя чувствительность,
• 3 - высокая чувствительность.

Сбор Л.В. Погорельской: семена конского щавеля, корни дурнишника и лист мяты перечной.

Из таблицы видно, что особенно высокая активность фитохитоде-за-02 проявляется в желудке и двенадцатиперстной кишке при рН<7, когда молекулы хитозана находятся в солевой, заряженной форме. Полагаем, что в тонком кишечнике при рН=7-7,3 хитозан частично остается в такой же форме, следовательно, его бактериальное действие продолжается. Осббенно выделяются грибковые микроорганизмы, которые не чувствительны ни к исследованным экстрактам, ни к соляной кислоте, но чувствительны к фитохитодезу-02 в воде без или с подкислением. Все это наглядно показывает существенные преимущества фитохитодеза-02, а также и других серий фИтохитодезов на основе хитозана полифракционного состава.

Коллективом авторов данной статьи разработана технология получения пригодного для медицинских целей анионного полиэлектролита на основе хитозана полифракционного состава - хитозанил-моноамида янтарной кислоты (ХМАЯК) [15]. В отличие от хитозана в форме катионного полиэлектролита ХМАЯК (хитодез*) проявил антибактериальную активность по отношению к сальмонелле и дизентерийной палочке [6]. Исследования антибактериальных свойств различных форм хитозана продолжаются.

Важно отметить, что получение на основе одного и того же природного полимера катионного или анионного полиэлектролита не только расширяет возможности создания различных полиэлектролитных комплексов с иммуномодуляторными свойствами [16], но и увеличивает диапазон антибактериального действия.

Способ получения фитохитодезов включает ряд достоинств, обеспечивающих эффективность применения целевых препаратов [17]. Известно, что в методах фитотерапии применяют лекарственные растения и их сборы при максимально возможном извлечении комплекса биологически активных соединений [18]. При получении настоев, отваров и жидких экстрактов из растительного сырья в заводских условиях извлекается не более 10-15 % биологически активных веществ (БАВ), а при многотоннажности загрузок потери БАВ увеличиваются [19]. Кроме этого, существуют проблемы,-связанные с дозированием, хранением и транспортировкой настоев, отваров и жидких экстрактов.

Эти недостатки в существенной степени устраняются при использовании сухих экстрактов, основными стадиями в технологии получения которых являются экстракция и высушивание водных экстрактов. С целью максимального извлечения БАВ из растительного сырья ГНИИ «Биоэффект» разработан специальный метод полифракционного извлечения БАВ. Для каждого сырья экспериментально подбираются экстрагенты и кратность обработки, затем производится распылительная сушка или лиофилизация в зависимости от термостабильности извлекаемых БАВ. При лиофильной сушке летучие компоненты: насыщенные и ненасыщенные органические кислоты, их эфиры и полиароматические соединения частично теряются [19].

При получении фитохитодезов применяется метод извлечения БАВ из лекарственных растений и их сборов в деминерализованной воде или в растворе олигомеров хитозана в форме катионного или анионного полиэлектролита в присутствии (и без) хлористоводородной кислоты. Это приводит к более полной экстракции из растительного сырья. Проведение основной стадии - лиофилизации жидких экстрактов в присутствии хитозана полифракционного состава позволяет в максимальной степени избежать потерь БАВ благодаря образованию прочных комплексов и хелатов, снижающих летучесть компонентов экстрагированных БАВ. Благодаря этому увеличивается количество экстрагируемых веществ до 15-20 % [17] и, очевидно, повышается биологическая активность целевого продукта.

Отметим, что хитозан или хитин представляет собой строительный материал для синтеза мукополисахаридов в клетках соединительной ткани. При наружном применении хитозан не только быстро проникает в кожу через устья волосяных фолликулов и через устья желез, но и активирует ферменты гиалуронидазу и р-глюкуро-нидазу, ответственные за диффузные процессы во внеклеточном матриксе. Если при пероральном применении фитохитодезов [2] также возможно проникновение хитозана в кровь и различные органы, то и в этом случае будет улучшаться транспорт во внеклеточном матриксе всех органов человека, а значит эффективнее будут отводиться продукты жизнедеятельности клеток и доставляться им питание. Если при этом учесть антиоксидантные свойства [20] не только экстракта фитосбора, но и хитозана, для которого эти свойства усиливаются при наличии аминогруппы в координационной сфере атома переходного металла (Zn, Си, Ni, Fe), то фитохитоде-зы в определенной степени могут выполнять роль адаптогенов (катализаторов в митохондриях), особенно те фитохитодезы, которые получены на основе многокомпонентных сборов лекарственных растений, когда препарат становится богатым не только различными экстрагируемыми органическими веществами по составу близ ким к адаптогенам, но и жизненно важными микро- и макроэлементами в легко усвояемой форме.

Скрининг по всем элементам образцов низкомолекулярного хитозана, хитодеза, сухого экстракта крапивы и фитохитодеза-02 показал, что во всех этих образцах содержатся не только атомы переходных металлов, но и макроэлементы, включая эссенциальные (Fe, Си, Zn, Со, Cr, Mo, Mn, Ni, V, As, Si, Li) и необходимые для иммунной системы (Fe, Си, Zn, Со, Cr, Mo, Mn, Li) [21], так и микроэлементы, включая редкоземельные (лантаниды и некоторые актиниды) (табл. 2). Важно обратить внимание, что количественный и качественный состав всех элементов существенно обогащается при использовании растительного сырья, причем, чем больше компонентов в фитосборе, тем ярче проявляется это различие, особенно характерно это изменение для редкоземельных элементов. Содержание токсичных элементов во всех образцах, как и следует ожидать по технологии получения, меньше предельно допустимой концентрации.

Существует мнение, что все элементы обладают определенной биологической ролью [22]. По соображениям необходимости полных сведений о влиянии на живые организмы различных элементов в определенных концентрациях, включая и редкоземельные, а также по экологическим соображениям важно учитывать состав не только макро- и микроэлементов, но и ультрамикроэлементов. Например, установлено, что лантаноиды не обладают канцерогенными и мутагенными свойствами, но при больших дозах - до 250 мг на 1 кг веса тела вызывают истощение внутриклеточного пула антиок-сидантов и стимулируют перекисное окисление липидов [21]. Но в умеренных и малых дозах установлено, что в образовании костной ткани определенную роль выполняют не только кальций, стронций, барий, иттрий, фосфор, но и редкоземельные элементы [22. стр. 22].

Таким образом, вышеизложенное позволяет заключить, что имму-нокоррегирующая и бактериостатическая роль хитозана полифракционного состава в хитозансодержащих сублингвальных фитопрепаратах наряду с положительным действием фитоэкстрактов, содержащих не только биологически активные вещества, но и различные элементы в усвояемой форме, обусловливают эффективность этих препаратов в профилактике и лечении различных заболеваний.

Таблица 2

Результаты атомно-эмиссионного и масс-спектрального анализов н/м хитозана, хитодеза, сухого экстракта крапивы и фитохитодеза-02

	no, мкг/г	С, мкг/г
Элемент		Хитозан н/м	Хитодез	Сухой экстракт крапивы	Фитохитодез-02
В Na Mg Al Si P S К Ca Ti Cr Mn Fe Ni Cu Zn Rb Sr Ba Pb	0,2 0,8 0,3 0,2 2 3 1 6 1 0,08 0,1 0,08 0,2 0,06 0,04 0,04 0,005 0,01 0,005 0,006	0,67 9807 1034 21,9 162 15,8 171 151 3744 2,6 10,8 2,8 93,8 30,7 2,3 7,4 0,052 13,8 1,5 0,24	0,76 4418 289 12,2 79,4 6,3 169 81,1 1613 1,1 5,5 2,2 31,4 5,5 1,5 5,3 0,078 8,0 0,79 0,11	20.0 3329 2792 20,4 341 341 2257 20961 6978 2,0 4,3 9,0 42,3 5,9 3,3 22,3 4,2 43,8 6,7 0,19	17,3 6683 3649 212 646 2124 2758 24150 11775 10,3 6,9 29,1 174 18,7 3,2 19,0 13,2 25,3 10,8 0,26
Элемент	no,	С, нг/г
	мкг/г	Хитозан н/м	Хитодез	Сухой экстракт крапивы	Фитохитодез-02
Li Be Sc V Co Ga As Se Y Zr Nb Mo Rh	2 3 69 60 20 40 6 62 1 3 5 4 2	90,1 <ПО < ПО <ПО 223,5 < ПО 152,8 < ПО 4,9 321 38,7 38,2 < ПО	68,9 < ПО < ПО < ПО 155,9 < ПО 62,5 < ПО 3,6 141 18.7 67,1 < ПО	73,5 < ПО < ПО < ПО 134,0 <ПО 47,2 < ПО 9,4 93,7 12,8 1760 < ПО	653 1766 < ПО 335 464 63 217 < ПО 51,6 367 108 274 <ПО

Продолжение таблицы 2

Pd	15	< ПО	< ПО	<ПО	< ПО
Ag	8	< ПО	< ПО	21,5	7,0
Cd	2	9,6	33,6	36,8	161
Sn	5	34,8	422	328	-
Sb	1	3,2	5,7	5,9	< ПО
Те	9	< ПО	< ПО	< ПО	< по
Cs	1	< ПО	< ПО	1,4	24,8
La	1	9,9	4,7	11,1	79,2
Ce	3	16,1	13,2	19,5	201
Pr	1	< ПО	1,1	4,5	22,7
Nd	1	4,9	5,2	11,8	75,6
Sm	1	< ПО	< ПО	< ПО	6,8
Eu	2	< ПО	< ПО	< ПО	< ПО
Gd	1	< ПО	< ПО	< ПО	15,0
Tb	0,9	<ПО	< ПО	< ПО	2,0
Dy	1	< ПО	< ПО	< ПО	16,2
Ho	0,5	< ПО	< ПО	< ПО	2,8
Er	1	< ПО	< ПО	< ПО	10,4
Tm	0,5	< ПО	< ПО	< ПО	< ПО
Yb	1	< ПО	< ПО	< ПО	< ПО
Lu	1	< ПО	< ПО	< ПО	< по
Hf	2	< по	< по	< ПО	7,8
Та	2	< по	< по	< ПО	3,5
W	8	117	28,8	58,1	88,4
Re	1	< ПО	< ПО	< ПО	< ПО
Ir	2	< ПО	< ПО	< ПО	< ПО
Pt	2	< по	< ПО	< ПО	< ПО
Au	3	< по	< ПО	< ПО	< ПО
Hg	4	26,8	< ПО	< ПО	< ПО
Tl	1	< ПО	< ПО	5,7	4,4
Bi	1	< ПО	< по	3,0	3,3
Th	1	2,0	2,2	3,7	29,9
U	1	25,4	17,5	8,5	21,3,

Лаборатория ядерно-физических и масс-спектральных методов анализа ИПТМ РАН. E-mail: karan@ipmt-hpm.ac.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Комаров Б.А. и др. Материалы 6 Межд. конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». 22-24 октября 2001. Москва-Щелково. Изд. ВНИРО. С. 187, 195, 230, 252.
2. Комаров Б.А. и др. Материалы 7 Межд. конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». 15-18 сентября 2003. Санкт-Петербург - Репино. Изд. ВНИРО. С. 198, 246, 367.
3. Трескунов К.А. Патенты РФ: № 2008012 от 30.05.1988; № 2007177 от 13.04.1987; № 2008013 от 11.03.1988.
4. Трескунов К.А., Комаров Б.А. Патент РФ № 2165252 от 20.01.1998.
5. Трескунов К.А., Комаров Б.А. Патент РФ № 2172634 от 18.08.1998.
6. Погорельская Л.В., Трескунов К.А., Трякина И.П., Комаров Б.А., Турьянов М.Х., Петрова Е.В. Патент РФ № 2174000 от 22.02.2000.
7. Комаров Б.А., Трескунов К.А., Фоменко А.С., Албулов А.И. Материалы научной конф. «Место фитотерапии в современной медицине». Черноголовка. 19-20 января 1999. С. 23.
8. Жоголев К.Д., Никитин В.Ю., Цыган В.Н., Егоров В.Н. Хитозан в медицине и рациональном питании. Серия: Медицина 21 века. СПб. 2000. С. 18.
9. Жоголев К.Д., Никитин В.Ю., Цыган В.Н. Препараты на основе хитина, хитозана в медицине и рациональном питании. Серия: Медицина 21 века. СПб. 2000. С. 12-20.
10. F. Fusetti, Н. von Moeller, D. Houston, H. J. Rozeboom, В. W. Dijkstra, R. G. Boot, J. M. F. G. Aerst, D. M. F. van Aalten. J. Biol. Chem. Vol. 277. Issue 28. P. 25537-25544. 12.07.2002.
11. Хайруллин P. M. khram@ufanet.ru. Частное сообщение.
12. Y. Kikuchi. Macromol. Chem. 175. 2209, 3593 (1974)
13. Червинец B.M. Докторская диссертация. Москва - Тверь. Апрель 2002.
14. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Ильина А.В., Зуева О.Ю., Варламов В.П. Материалы 7 Межд. конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». 15-18 сентября 2003. Санкт-Петербург - Репино. Изд. ВНИРО. С. 233.
15. Комаров Б.А., Албулов А.И., Белов М.Ю., Самуйленко А.Я., Фоменко А.С., Шинкарев СМ., Трунов A.M. Патент РФ № 2144040 от 07.04.1998.
16. Андронова Т.М., Дозмаров И.М., Мустафаев М.И. и др. Синтетические иммуномодуляторы. М: Наука. 1991. С. 97.
17. Комаров Б.А., Албулов А.И., Трескунов К.А., Погорельская Л.В., Червинец В.М. Патент РФ № 2204402 от 14.06.2001.
18. Фитотерапия Методические рекомендации. № 2000/63 МЗ РФ М: 2000.
19. Успенская СИ., Дюкова В.В., Романенко Е.Б., Прохорова Л.В., Лапин А.Б., Леонидов Н.Б. Сухие растительные экстракты - новая технология, новое качество. Российский хим. журнал 1997. Т. 41. № 5. С. 124.
20. Эмануэль Н.М. Химическая физика старения и стабилизации полимеров. М: Химия. 1982. С. 282.
21. Кудрин А.В., Скальный А.В., Жаворонков А.А., Скальная М.Г., Громова О.А. Иммунофармакология микроэлементов. М: Изд. КМК. 2000. С. 18.
22. Кист А.А. Феноменология биогеохимии и бионеорганической химии. Ташкент. Изд: ФАН. 1987. С. 8.